發布(bu)日期：2022-05-26 12:54 瀏覽次數(shu)： 作(zuo)者：admin
生化測定的目的是解明某種生物學現象產生的代謝機制，為進一步通過分子生物學和細胞生物學等手段，研究該生物學現象的調控機制提供線索。
為實現上述目的，就需要確保生化測定結果的可靠性、真實性和可用性。
1. 生化測定結果的可靠性
生化測定結果的可靠性是指生化測定結果能夠可靠地反映某種生物學現象與某個代謝的聯系。
生化測定結果的可靠性取決于生物樣本的典型性、代表性和重復性，以及測定指標的合理性。
1.1 生物樣本的典型性
生物樣本的典型性是指與對照組相比，處理組能夠穩定地出現某種生物學現象。
如果處理組和對照組在某種生物學現象上不存在顯著差異，那么就不應該進一步進行生化測定，否則容易得出錯誤結論。
假如某個代謝確實與該生物學現象相關，由于處理組與對照組在該生物學現象上不存在顯著差異，則生化測定結果必然也不存在顯著差異，從而得出某個代謝與該生物學現象無關的錯誤結論。
相反，假如某個代謝確實與該生物學現象無關，由于處理組與對照組在該生物學現象上不存在顯著差異，則生化測定結果在處理組和對照組之間可能不存在顯著差異，也可能存在顯著差異。如果生化測定結果存在顯著差異，那么就會得出錯誤結論，誤認為該種生物學現象與這個代謝的變化有關！
取樣缺乏典型性，是導致生化測定結果可靠性差的首要原因。
1.2 生物樣本的代表性
生物樣本的代表性是指所取樣本能否代表本組（處理組內或者對照組內）的整體狀態。
通常難以嚴格控制全部環境條件，因此同一組內不同個體的生長發育總是存在一些差異。所取樣本應該從該組內大多數個體中選取，即排除生長發育最好和最差的兩部分個體。
一般來說，實驗室中培養的生物，其生長發育的差異要顯著小于大田培養的生物，野外生物的生長發育差異最大。
如果取樣缺乏代表性，那么生化測定結果也就缺乏代表性，不能代表處理組或者對照組的整體狀態。
取樣缺乏代表性是導致生化測定結果可靠性差的第二個原因。
1.3 生物樣本的重復性
為了排除隨機因素的影響，從統計學的角度要求設置重復樣本。
生物樣本的重復性是指在某一個取樣時間點，所取重復樣本（所取的某個組內的三個以上樣本）相互之間差異的大小。
重復樣本之間差異越大，則生化測定結果的差異就越大，即重復性越差。
生物樣本的重復性和測定本身的重復性兩者共同決定了生化測定結果的重復性。
取樣缺乏重復性是導致生化測定結果可靠性差的第三個因素。
此外，在保存過程中生物樣本發生變質，或者擬測定指標，如易氧化的物質或者易失活的酶類，發生了顯著變化，也是導致生化測定結果可靠性差，甚至測定失敗的重要原因。
2. 生化測定結果的真實性
生化測定結果的真實性是指生化測定結果反映了所測定生物樣本中所測定指標的真實情況。
生化測定結果的真實性取決于測定方法、測定用品和測定操作。
2.1 測定方法的專一性、重復性和簡便性
研究者一般根據測定指標、生物樣本特點和所具備的測定條件，選擇適合的測定方法。
但是，就測定方法本身來說，應該依次按照檢測對象的專一性、測定結果的重復性和測定操作的簡便性來比較同一指標的不同測定方法。檢測對象不專一，測定結果無效；測定結果重復性差，測定結果不能用；測定操作不簡便，步驟越多，誤差就越大，而且測定成本（費用、時間和精力等）也就越高。
測定方法的專一性、重復性和簡便性不好是導致生化測定結果真實性差的首要因素！
2.2 測定用品的質量和性能
工欲善其事必先利其器。測定用品包括儀器設備、試劑和耗材。
舉個例子：與分光光度計相比，酶標儀具備兩個優勢：（1）測定效率高，一次可以掃描整塊酶標板；（2）測定結果重復性好，可以自動振蕩混勻反應體系和控制反應溫度。
測定用品的質量和性能不好是生化測定結果真實性差的重要因素。
2.3 測定操作規范和到位
測定操作規范是指測定人員嚴格按照說明書操作儀器設備、配制各種試劑和測定各步驟。
測定操作不規范是導致測定不能順利進行，甚至徹底失敗的主要原因之一。例如，酶標儀不預熱，冷凍離心機不預冷，臨用前配制試劑配制過早或者使用時間過長，漏加試劑等。
測定操作到位是指該步操作確實達到了目的。
測定操作不到位是導致測定結果不真實，如數據變化不規律，重復性差的主要原因之一。例如，哺乳動物酶活性測定一般要求在37oC中進行。但是，測定人員在酶標儀上設定了37oC，但是沒有把試劑，尤其是占體積比例最大的緩沖液，預熱到37oC；而是從冰箱里取出后直接加大酶標板的反應孔里。一般酶活性測定也就反應90秒，這樣的話，從反應開始到反應結束，即測定過程中反應體系的實際溫度遠遠低于37oC。按照化學反應的溫度系數（Q10），酶活性測定結果就會嚴重偏低，甚至接近于零，這樣的測定結果當然不真實，導致得出錯誤結論。
測定操作不規范和不到位是導致生化測定失敗，或者生化測定結果不真實，偏高或者偏低，重復性差，數據變化不規律的最常見原因！
3. 生化測定結果的可用性
除了上述生化測定結果的可靠性和真實性外，還要注意生化測定結果的可用性。
生化測定結果的可用性依次指（1）生化測定數據本身的好壞，（2）根據這些生化測定數據，能否得出明確、可靠的研究結論，（3）這些生化測定數據能否支撐起一篇高水平的研究論文。
3.1 生化測定數據本身的好壞
評價生化測定數據本身的好壞，主要看其（1）變異系數（標準誤/平均值）大小，即重復性；（2）平均值的變化范圍，是否嚴重偏離文獻報道值；（3）變化趨勢，即組內數據變化是否有規律；（4）組內和組間是否存在顯著差異，尤其是處理組與對照組差異是否顯著。
如上所述，生化測定數據的變異系數取決于生物樣本的重復性和測定本身的技術重復性。必須指出的是，并不是變異系數越小越好。如果變異系數太小，可能會導致錯誤結論，即本來差異不顯著，卻判斷為顯著，而且往往會引起審稿人的懷疑。 如果變異系數確實比較大，那么可以檢查一下技術重復性和生物樣本重復性，如果技術重復性還好，而是生物樣本重復性差，那么增加測定重復次數，例如從3次增加為5次，就可以把變異系數降為原來的一半。也可以嘗試做一下差異顯著性檢驗，或許檢驗結果是差異顯著呢。
如果測定的平均值嚴重偏高或者偏低，那么就容易引起審稿人的懷疑。此時需要（1）細查測定和計算情況，是否存在錯誤；（2）核對文獻報道中所采用的測定方法、生物樣本和計算單位（尤其是干重還是鮮重）是否具有可比性；（3）文獻的權威性，如各種國家或者行業標準的權威性就顯著高于研究論文，權威期刊的可信度就高于普通期刊，大多數研究論文就高于個別研究論文等；（4）物種的內穩態情況，例如哺乳動物的血糖濃度變化范圍就顯著小于昆蟲等。當然，如果確實偏離比較嚴重，就需要查找真正的原因，否則只能放棄這批數據。
如果組內測定數據變化無規律，通常是由于取樣或者測定本身造成的，例如取樣缺乏典型性和代表性，測定時勻漿提取程度不一致，或者計算時作為分母的指標本身變化不規律，當然也可能是該代謝與所研究的生物學現象無關。
如果上述變異系數、偏離程度和變化規律三個方面都沒有問題，那么組內和組間差異是否顯著，這個是不能強求的。可能情況包括（1）如果該代謝的測定指標都沒有顯著差異，那么所研究生物學現象確實與這個代謝無關，（2）所研究生物學現象與某個測定指標的變化無關，而是與其它指標有關，例如H2O2含量下降，既可能是合成酶活性下降了，也可能是分解酶活性上升了，甚至合成酶活性下降的同時分解酶活性也上升，即使是降解酶活性上升，也可能出現CAT、POD和GPX活性都升高，或者至少其中某個或者兩個升高，其它不變，甚至個別降低。
3.2 能否得出可靠、明確的研究結論
如果測定數據本身沒有問題，那么根據現有測定結果，能否得出可靠、明確的研究結論，就主要取決于測定指標的選擇是否合理，尤其是有沒有集中選擇該代謝已知的可測定的全部指標！
選擇某個代謝的已知的可測定的全部指標，不同測定指標的測定結果就可以相互驗證和相互配合，從而得出明確、可靠的研究結論：所研究的生物學現象與某個代謝相關，即主要由哪種物質含量變化引起，而且該物質含量的變化是由哪個或者哪幾個酶活性變化調控的。
如果漏測，則不能得出可靠、明確的研究結論。如果多測一些其它代謝的指標，則這些指標的測定結果對于得出可靠、明確的研究結論沒有幫助，至少浪費。
3.3 生化測定數據能否支撐起一篇高水平的研究論文
一篇高水平的研究論文，不僅需要有可靠、明確的研究結論，而且也需要足夠的內容，尤其是測定數據！
除了上述要集中選擇某個代謝已知的可測定的全部指標外，還需要反映代謝的變化過程。一般而言，測定指標要5個以上，取樣時間點也要5個左右。只有這樣，才能有足夠的內容支撐起一篇高水平的研究論文。
以上是我個人的一些粗淺看法，只能算拋磚引玉。不當之處，歡迎大家批評指正，希望對生命科學研究者能夠有所啟發。
祝大家研究順利，取得更多、更大研究成果，導師優質結題，研究生順利畢業！